Разработка ИФА-дигностикума для определения антител к вирусу энтерита гусей

А. В. ЦиновыйИнститут птицеводства НААНУ, г. Харьков

Разработан новый способ очистки и концентрирования вируса энтерита гусей.Вирус идентифицирован с помощью электрофоретических исследований в полиакриламидном геле, а также электронной микроскопии. При очистке и концентрированиивируса инфекционный титр, в сравнении с исходным повысился на 2,0 lg ТЦД50/см3. Получены гипериммунные и негативные сыворотки для ИФА-диагностикума, отработаныоптимальные соотношения компонентов для конструирования тест-системы ИФА,выведена формула пересчета титров антител в сыворотках крови гусей при тестировании их в одном разведении. Определен позитивно-негативный порог дляданногодиагностикума (какие из исследуемых сывороток имеют позитивный, сомнительныйлибо негативный титр антител к возбудителю вирусного энтерита гусей).

ВВЕДЕНИЕ
Вирусный энтерит (ВЭГ, болезнь Держи, Enteritis viralis anserculorum) – острая контагиозная болезнь молодняка гусей и мускусных уток, которая характеризуется воспалением желудочно-кишечного тракта и высокой летальностью – до 30-90%. Болеет птица в возрасте от 1 до 30 дней. Возбудитель заболевания парвовирус из семейства Parvoviridae [1].

Диагностика этого заболевания затруднена. Коммерческий стандартный набор для экспресс-диагностики отсутствует как в Украине так и в других странах мира.

Существуют методы серодиагностики ВЭГ: реакция нейтрализации (РН), реакция диффузной преципитации (РДП) [10], реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) [1]. РДП и РНГА по чувствительности и специфичности значительно уступают реакции нейтрализации, которая в свою очередь трудоёмкая и занимает большое время при постановке.

По данным зарубежных ученых для диагностики вирусного энтерита гусей также используют анализ бляшек [17] и твердофазный иммуноферментный анализ [14,15,16].

На сегодняшний день существует насущная необходимость в разработке высокочувствительного экспресс-метода диагностики, который ускорит проведение научных исследований.

Основным методом экспресс-диагностики на сегодня является реакция иммуноферментного анализа (ИФА), которая имеет высокую чувствительность, безопасность, скорость постановки, стандартизацию обсчета и компьютерную обработку результатов [3,8]. Этот метод успешно используется для выявления как вирусных антигенов, так и специфических антител у животных-реконвалесцентов или иммунизированных противовирусными вакцинами [5,6,8].

Реализация идеи получения диагностических наборов ИФА требует решения сложных и разнообразных заданий. Это, прежде всего, выделение антигенных фракций, изучение их структуры, физико-химических и иммунобиологических свойств, которые определяют специфичность конкретного антигена.

Основой качества любого диагностикума ИФА является очистка антигена, который в дальнейшем наносится на планшеты. Мы в своей работе обратили на это особое внимание.

В предыдущие годы парвовирус гусей пробовали очищать с помощью макропористой гель-хроматографии [11], ультрафильтрацией через специальные фильтры [4], но достичь такого уровня очистки вируса, как при использовании метода ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы-хлористого цезия не представлялось возможным [12].

Малый размер парвовируса гусей (20-25 нм), а также его тесная связь с клеточными мембранами, обуславливает трудности при его очистке. Эти трудности можно преодолеть разными путями, например, увеличить обороты при ультрацентрифугировании или время центрифугирования. Это в свою очередь экономически невыгодно.

Целью настоящей работы являлась разработка отечественной диагностической тест-системы на основе непрямого ИФА для выявления антител к возбудителю ВЭГ при одном разведении исследуемой сыворотки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
– вакцинный штамм вируса энтерита гусей BBS-99, который получали в культуре клеток фибробластов эмбрионов гусей общепринятым методом. Биологическая активность его до очистки была равна 7.5 lg ТЦД 50/см3.
Было использовано следующее оборудование при очистке вируса:
– центрифуга РС – 6 и ультрацентрифуга МSE;
– проточный спектрофотометр LKB 2238 “Uvicord S” с калибратором фракций и самописцем – для сканирования вирусных фракций в градиенте плотности сахарозы хлористого цезия;
– диспергатор УЗДН–А – для проведения ультразвуковой обработки вирусного материала;
– аппараты LKB 2117 Multifor System та LKB 2197 Constant Power Supply и гель 120 х 250 х 0,5 мм на подкладке Gel Bond (Serva, Германия) – для проведения электрофореза в полиакриламидном геле.

Просмотр образцов при электронной микроскопии осуществляли с помощью электронного микроскопа ПЭМ-125К при ускоряющем напряжении 75 kV, который имеет в своем составе систему съемки и анализа изображения САІ – 01А (AO “SELMI”, м. Сумы) на основе CCD камеры DX – 2.

Рекомендуем прочитать:  Особенности ухода за собакой зимой

Качество очистки проверяли с помощью:
– определения биологической активности вируса путем титрования на культуре клеток гусиных фибробластов;
– определения концентрации белка в полученных фракциях по методу Бредфорда [2];
– электронной микроскопии методом негативного контрастирования [7];
– электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Gorg А. [13] в сравнении с стандартными белками фирмы «Fermentas» (14 белков с известными массами в килодальтонах).

Д ЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИСПОЛЬЗУЮТ СЛЕДУЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:
Иммуноспецифические компоненты.
– полистироловые планшеты (Nunc), сенсибилизированные культуральным антигеном штамма ВВS- 99;
– нормальная сыворотка (сыворотка полученная от 30 – ти дневных гусят, которые содержались в камеральных условиях);
– положительная сыворотка (специфическая сыворотка крови гусей иммунизированных очищенным антигеном из штамма ВВS- 99);
– антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против Ig G гусей.

Неспецифические компоненты.
В качестве субстрата использовали АБТС (2,2-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту с перекисью водорода, в качестве «стоп-раствора» – 5% – ный додецилсульфат натрия, в качестве буфера для разведений и отмывочного буфера трис-буфер с 0.1% твин-20 (рН 7.4-7.6).

Исследуемые сыворотки. Анализировали пробы сывороток крови гусей, присланные птицеводческими хозяйствами для исследования, не содержащие микроскопических признаков бактериальной и грибковой микрофлоры.

ИФ-тест.
Непрямой вариант ИФА проводили по схеме, которая используется при постановке реакции в ФГУ ВНИИЗЖ (г. Владимир) [9].

Измерения производили на ридере Star Fax – 2100 на дифференциальном фильтре при длине волны 405 нм.

Использовали стандартный метод последовательных разведений сыворотки.

Титром исследуемой сыворотки считали величину ее наибольшего разведения оптическая плотность которого двукратно превышала соответствующий средний показатель отрицательного контроля [9].

РЕЗУЛЬТАТЫ
Основой нашей работы является разработка метода очистки вируса, поэтому мы считаем нужным кратко описать его.

При первичной очистке материал обрабатывали 8% ПЕГ-6000 (полиэтиленгликоль) и центрифугировали.

Следующий этап заключался в обработке вирусной суспензии ультразвуком при 22 кГц. Далее вирусную суспензию центрифугировали через раствор 30% сахарозы.

В предыдущих очистках вируса мы не использовали детергенты. При электрофоретических исследованиях конечных образцов в ПААГ было обнаружено несколько белков, которые по молекулярному весу не относятся к вирусным и являются балластными. Поэтому возникла потребность в использовании на данном этапе детергентов для удаления этих белков.

Было использовано несколько вариантов дальнейшего продолжения очистки вируса и проведен их сравнительный анализ.

Вирус очищали без детергентов, а также с использованием детергентов – саркозила и нонидета Р-40.

При проведении сравнительного анализа к пробам с вирусной суспензией добавляли в определенной концентрации либо саркозил либо нонидет Р-40 (пробы без детергентов служили контролем) далее их наслаивали на градиент плотности сахарозы – хлористого цезия (удельная плотность 1.038-1,439 г/см3) и центрифугировали.

После центрифугирования градиенты сканировались на проточном спектрофотометре при длине волны 280 нм.

По результатам сканирования на самописце, по пикам гаусовых кривых, отбирались основные фракции.

Полученные фракции повторно осаждались через раствор 30 %-й сахарозы и ресуспензировались в TSE-буфере (рН 7.6) в объёме 1/100 от исходного. От всех трех образцов были взяты пробы для проведения электронной микроскопии и для электрофореза в ПААГ.

Наилучшие результаты были получены при использовании мягкого неионного детергента нонидет Р-40. Потому он использовался в последующей работе.

При электрофорезе в ПААГ проба, в которой при очистке вируса использовался нонидет Р-40, не имела балластных белковых компонентов, а имела только белки, которые относятся к вирусу (85 кДа). (Рис.1)

Рисунок 1 Электрофореграммы (1,7 – стандарты; 2 – очистка без детергентов; 3 – очистка с саркозилом;

Электронно-микроскопическими исследованиями проб с нонидетом Р-40 выявлены вирионы размером 20-22 нм, которые по морфологическим характеристикам относятся к вирусу энтерита гусей (Рис.2).

Рис. 2. Вирус энтерита гусей. Увел. х 127 000

Вирус энтерита гусей

При сканировании линейных градиентов данные, по количеству вируса и его чистоте в образце с нонидетом Р-40 были оптимальными (Рис.3) .

Рис. 3 Результаты сканирования (1 – очистка без детергентов; 2 – очистка с саркозилом; 3 – очистка с нонидетом).

Рекомендуем прочитать:  Карликовый буйвол: аноа с острова Сулавеси, поведение в природе, угроза исчезновения вида

Результаты сканирования линейных градиентов по количеству вируса и его чистоте в образце с нонидетом Р-40

После очистки и концентрирования биологическая активность вируса энтерита равнялась 9,2-9,5 lg ТЦД50/см3, что на 2 lg ТЦД 50/см3 выше, чем в исходном материале.

Содержание белка в исследуемых пробах колебалось от 200 до 500 мг/мл.

Таким образом, анализируя полученные нами результаты по очистке и концентрированию вируса энтерита гусей, можно сделать вывод, что полученный таким методом антиген пригоден для разработки тест-системы иммуноферментного анализа.

Разработка диагностической тест-системы на основе непрямого ИФА для выявления антител к возбудителю ВЭГ.

Разработка ИФА-диагостикума ВЕГ состоит из нескольких этапов, которые мы приводим ниже:
1. Получение специфических гипериммунных и негативных сыворотоккрови гусей

Для получения специфических гипериммунных сывороток проводилась иммунизация гусят 30 дневного возраста по следующей схеме ( Табл. 1).

Таблица 1. Схема иммунизации.

Иммунизация

Материал для иммуни-
зации

Титр материала,
lg ТЦД 50/см3

Интервал между иммуни-
зациями

Способ введения, доза

1

очищенный вирус
ВВS – 99

10,5

7 суток

подкожно
0,56 ·1010 ТЦД 50/ 0.5 см3

2

очищенный вирус
ВВS – 99

подкожно
0,56 ·1010 ТЦД 50/ 0.5 см3

3

очищенный вирус
ВВS – 99 + Монтанид
ІSA – 70 1:1

внутримышечно
1,12 · 1010 ТЦД 50/ 1 см3

Через 14 дней после заключительной иммунизации титр в реакции нейтрализации (РН) составлял 1:5120.

Негативная сыворотка крови гусей была получена от клинически здоровых гусят 30-ти дневного возраста, которые выращивались в камеральных условиях. Титры в РН негативных сывороток были нулевые.

2. Выбор рабочего разведения сыворотки и определение коэффициентов уравнения линейной регрессии

Для определения оптимального разведения исследовали 154 сыворотки крови гусей с титрами антител к возбудителю энтерита от 1:100 до 1:12800, методом последовательных разведений.

Для разведений 1:100, 1:200, 1:400 исследованных сывороток с определенным титром вычисляли значения S/P и определяли коэффициент корреляции между логарифмированными значениями величин титров и соответствующих им S/P отношений [9].

Были получены коэффициенты корреляции для разведения 1:100 – 0.86, 1:200 – 0.93, 1:400 – 0.92, наиболее приемлемым для постановки реакции в одном разведении сыворотки является разведение 1:200, дающее возможность получать достоверные результаты при исследовании сывороток (коэффициент корреляции был наиболее высоким).

Ставя перед собой задачу исследовать в одном разведении сыворотки с высокими титрами, нам следует найти корреляционную зависимость между lg T и lg S/P именно для таких сывороток.

Определить значение титра можно по калибровочной кривой, представленной на рис. 4

Рис. 4 Калибровочная кривая для определения титра

Калибровочная кривая для определения титра

Используя математически выраженную линейную зависимость для lg T и lg S/Р, имеющую вид lg T= А + В * lg S/Р, было выведено уравнение линейной регрессии для выбранного нами разведения 1:200:

lg T=3,2899+1,3436 * lg S/Р

3. Определение позитивно-негативного порога (ПНП)
Пятьдесят четыре заведомо отрицательных сыворотки крови полученных от гусят содержащихся в камеральных условиях исследовали методом последовательных разведений. Позитивно-негативный порог определяли путем расчета средних значений оптической плотности исследуемых сывороток для каждого разведения, прибавляя три значения стандартного отклонения.

Результаты расчетов представлены в табл. 2.

Таблица 2 Стандартное отклонение разведений сыворотки, не имеющей антител к возбу-
дителю энтерита гусей с учетом стандартной ошибки

Разведения

Количество проб

Среднее
значение

Минимальное
значение

Макс. значение

Стандарт. отклонение

Стандартная
ошибка

1:100 

54

0,196278

0,115

0,310

0,044788

0,006151

1:200 

54

0,128611

0,075

0,208

0,030063

0,004129

1:400 

54

0,097796

0,058

0,156

0,021404

0,002940

1:800 

54

0,079352

0,051

0,131

0,018116

0,002488

1:1600 

54

0,066944

0,041

0,112

0,015719

0,002159

1:3200

54

0,059389

0,039

0,088

0,012099

0,001661

1:6400

54

0,054296

0,031

0,078

0,011796

0,001620

1:12800

54

0,051852

0,033

0,072

0,009944

0,001365

Дальнейший расчет ПНП определялся в соответствии с методическими указаниями, которые были разработаны ФГУ ВНИИЗЖ (г. Владимир) [9].

Значение титра, которое соответствует нижнему положительному титру антител к возбудителю энтерита гусей равно 265.

Рекомендуем прочитать:  Бензилпенициллина — инструкция по применению соли

Исследования продолжаются.

ВЫВОДЫ
Разработан новый метод очистки и концентрирования вируса энтерита гусей.

Разработаны основные технологические параметры тест-системы ИФА в одном разведении сыворотки. Данная тест-система пригодна для исследования иммунного статуса вакцинированной птицы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Білецька Г. В. Вивчення епізоотичного статусу щодо вірусного ентериту гусей методом серомоніторингу / Г. В. Білецька, І. Ю. Безрукава, Н. М. Пересада // Птахівництво: міжвід. темат. наук. зб. / ІП УААН. – Х., 2004. – Вип. 55. – С. 235-238.
2. Бредфорд М. Методика определения белка по Бредфорду / М. Бредфорд // Справочник биохимика.- М. : Высшая школа, 1991. – С. 466-467.
3. Егоров А. М. Теория и практика ИФА / А. М. Егоров, А. П. Осипов,Б. Б. Дзантиев. – М. : Высшая школа, 1991. – 288 с.
4. Ерофеев С. Г. Концентрирование парвовируса свиней ультрафильтрацией / С. Г. Ерофеев, В. В. Борисов, Т. З. Байбиков // Сборник материалов научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы», 23-25 мая 2001 г. – Киров, 2001. – С. 23-24.
5. Іванська Н. В. Практичний посібник з імуноферметного аналізу / Іванська Н. В., Кислих О. М., Максименко О. В.; під ред. А. Л. Гураля та М. Я. Співака. – Київ, 2003. – 51 с.
6. Нго Т. Т. Иммуноферментный анализ / Т. Т. Нго, Г. Ленхофф. – М. : Мир, 1988. – 387 с.
7. Королев М.Б. Электронно-микроскопические методы выявления вирусов / М.Б. Королев // Итоги науки и техники, сер. Вирусология, т. 9 – М.: – 1980. – С. 114-157
8. Методические рекомендации по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом / ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 1998.- С. 6-9.
9. Методические рекомендации по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций Ч.1 / ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2008. – 306 с.
10. Трефилов Б. Б. Специфическая профилактика вирусного энтерита гусей / Б. Б. Трефилов // Вирусные болезни с.-х. животных.- Владимир, 1995. – С. 277.
11. Трефилов Б. Б. Оценка поствакцинального иммунитета при вирусном энтерите гусей методом иммуноферментного анализа / Б. Б. Трефилов, Н. В. Никитина, Д. В. Маслов // Материалы международ. науч.–практ. конф., посвященной 110–летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, 21 – 22 сентября 2006 г. – 2006. – С. 200 – 206.
12. Фадель Г. А. Метод ИФА для диагностики вирусного энтерита гусей / Г. А. Фадель, Л. М. Надточей, А. В. Контримавичус // Ветеринария. – 1989. – № 7. – С. 36-39.
13. Gorg A. Horizontal SDS electrophoresis in ultrathin pore-gradient gels for the analisis of urinary proteins / A. Gorg, W. Postel, J. Weser // Scince Tools. – 1985. – Vol. 32, № 1. – C. 5-9.
14. Have P. Detection of goose parvovirus antibodies by microneutrelis and enzyme – linked immunosorbentassay / P. Have, H. S. Hansen // Proc. 7 th. World Vet. / Poult. Assoc. – Oslo, Norway, 1993. – P. 60.
15. Jestin V. Demonstration of very pathogenic parvovirus ( Derzsy disease virus) in Muscavy duck farms / V. Jestin, M. Le Bras, M. Cherbonnel // Reel. Med. – 1991. – Vet. – V. 167 – P. 849 – 857.
16. Kwang M. J. Detection of antibodies against goose parvovirus by on enzyme – linked immunosorbent assay(ELISA) / M. J. Kwang, H. J. Tsai, Y. S. Lu // J. Chin. Soc. Vet. Sci. – 1987. – V. 13 – Р. 17 – 23.
17. Takehara R. Issolation identification and plaque titration of parvovirus from Muscovy ducks in Japan / R. Takehara, K. Hyaktaka, K. Immamura // Avian Dis. – 1994. – V. 389. – P. 810 – 815.

Подготовлено по материалам «VIого Международного Ветеринарного Конгресса по Птицеводству» для webmvc.com

Добавить комментарий