ПЦР-диагностика хламидиоза у попугаев

Равилов Р.Х., Кострова А.В., Вафин Р.Р.
ФГОУ ВПО “Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана”,
г. Казань

В настоящее время ведущим направлением в исследовании хламидиоза является молекулярно-биологические методы индикации и идентификации хламидий – ПЦР, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), секвенирование ДНК и другие. 

Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, воспроизводимостью и возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и межштаммовые различия хламидий. 

Хламидиоз среди птиц имеет широкое распространение (не менее 132 видов), особенно у попугаев, голубей, уток, индюков и гусей. Птицы являются резервуаром Chl. psittaci в природе, среди которых насчитывается. Исследователи неоднократно указывают на декоративных птиц как на потенциальный источник хламидий. Владельцы декоративных птиц не всегда информированы о возможности заражения хламидийными инфекциями от своих питомцев. 

Материалом для исследования служил клинический материал от попугаев, которым был поставлен диагноз на хламидиоз методом люминисцентной микроскопии (РИФ) и серологическими тестами (РСК). При подготовке проб патологического материала для ПЦР 100 мкл суспензии на дистиллированной воде кипятили в течение 10 минут в герметичных пробирках Eppendorf, центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость использовали для постановки ПЦР.

ПЦР проводили с использованием специфичных для Chl. psittaci олигонуклеотидных праймеров, предложенных R.G.Hewinson et al. (1997).

“CPF”: 5’-GCAAGACACTCCTCAAAGCC-3’;

“CPR”: 5’-CCTTCCCACATAGTGCCATC-3’.

Разработанный ПЦР-тест основан на амплификации фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов, который включает в себя 5’-нетранслируемый регион и часть гена Chl. psittaci, кодирующего синтез большого белка наружной мембраны возбудителя.

Продукты амплификации вносили в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04М трис-ацетат, 0,002М ЭДТА, рН 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подтвергали горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 10В/см в течение 1,5-2 часов с последующим просматриванием фореграмм в УФ-трансиллюминаторе (290-330нм) и фотографированием, используя оранжевый светофильтр. Образовавшиеся продукты амплификации идентифицировали относительно положительного контроля или используя ДНК-маркеры.

Рекомендуем прочитать:  Испытание композиционных смесей для обработки инкубационных яиц

Результатом ПЦР патологического материала со специфичными праймерами “CPF” и “CPR” явилась амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили возможность индикации возбудителей хламидиоза в клиническом материале, полученном от попугаев с использованием искусственно синтезированных олигонуклеотидных праймеров “CPF” и “CPR”. 

Summary

Ravilov R.Kh., Kostrova А.V., Vafin R.R.: PCR-diagnostics of chlamydiosis at a parrot. Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Kazan, Russia.

The opportunity of indication chlamydiosis at parrots with use PCR is confirmed.

Источник: материалы Московского международного ветеринарного конгресса

Добавить комментарий