Анализ структуры генов 16S рРНК, 23S рРНК и экстрахромосомной плазмиды у хламидий

Вафин Р.Р., Каримов М.З., Равилов Р.Х.
Казанская государственная академия ветеринарной медицины г. Казань

Введение
Данные филогенетического анализа первичной структуры генов 16S рРНК и 23S рРНК различных представителей порядка Chlamydiales послужили основой для изменения номенклатуры и таксономии хламидий и родственных им микроорганизмов. На основании филогенетического анализа рибосомных генов в семействе Chlamydiales утверждены 9 видов хламидий, три из которых: Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis и Chlamydia muridarum включены в род Chlamydia, a остальные шесть: Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophil felis, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pneumoniae и Chlamydophila pecorum включены в род Chlamydophila [5].

Целью данной работы являются молекулярно-генетические исследования типичных представителей рода Chlamydophila из коллекции микроорганизмов ФГУ “Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных” (ФЦТРБ) на предмет их таксономической принадлежности, на основании сравнительного анализа по 16S рРНК-, 23S рРНК с соответствующими фрагментами геномов официально зарегистрированных видов хламидий, а также наличию экстрахромосомной плазмиды.

Материалы и методы. В работе использовали 4 штамма хламидий: Ростиново-70 [1], 250 [2, 3], ПП-87 [4] и КС-93 [4] из коллекции микроорганизмов ФГУ ФЦТРБ, выделенные соответственно от овцы, коровы, песца и собаки.

Желточные оболочки куриных эмбрионов, инфицированные хламидиями, были гомогенизированы в сахарозо-фосфатном буфере. Суспензии центрифугировали при 200g в течение 10 минут при 40С, супернатант подвергали лиофильной сушке.
ДНК хламидий экстрагировали из лиофильно высушенных штаммов гуанидинизотиоцианатным методом («Рибосорб» ЦНИИЭМ, Россия), предварительно растворив лиофилизат в дистиллированной воде.

Для амплификации фрагмента 16S рРНК использовали праймеры 16SIGF 57- CGGCGTGGATGAGGCAT-3/ и 16SIGR 5/-TCAGTCCCAGTGTTGGC-3/ [5]; 23S рРНК – U23F 57- GATGCCTTG GCATTGATAGGCGATGAAGGA-3/ и 23SIGR 5/-TGGCTCATCATGCAAAAGG CA-3/ [5]; экстрахромосомной плазмиды – ML-PLF01 5/-CAGAACGGTGTGT AGATT-3/ и ML-PLR01 5- AGGAGATAAGGTTGCTAA-3/ [6].

Амплификацию участков генома хламидий проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК- технология», Россия). Хламидийные 16S рРНК-, и 23S рРНК-фрагменты и ДНК экстрахромосомной плазмиды были амплифицированы в объемах по 20 ц!. Реакционные смеси содержали по 1 ц! исследуемого препарата ДНК, 200 цМ dNTPs (НПО «Сиб Энзим», Россия), по 0,5 цМ каждого из соответствующих праймеров (НПО «СибЭнзим», Россия), 2 ц! 10хбуфера (НПО «СибЭнзим», Россия) и 1 Ед Taq ДНК полимеразы (НПО «СибЭнзим», Россия). Режимы амплификации: 16S рРНК: 1*940С – 4 мин; 40х94°С – 30 сек, 510С – 30 сек, 720С – 30 сек; 1х720С – 7 мин. 23S рРНК: 1х940С – 4 мин; 40х94°С – 30 сек, 610С – 30 сек, 720С – 30 сек; 1х720С – 7 мин. Экстрахромосомная плазмида: 1х940С – 4 мин; 40х940С – 30 сек, 520С – 30 сек, 720С – 30 сек; 1х720С – 7 мин.

Рекомендуем прочитать:  Мандариновое дерево в домашних условиях уход | FermerOk.com - Ферма своими руками

ПЦР-продукты, амплифицированные с вышеперечисленными праймерами обрабатывались 1 Ед AluI (НПО «СибЭнзим», Россия) при 370С в течение ночи (10 ц! ПЦР-продукта, 7,0 ц! dH2O, 2,0 ц! 10хбуфера, 1 Ед/ц! AluI). Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ проводили методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0) содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (А=310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартным ДНК маркером 100-1500 пар оснований (п.о.) (НПО «СибЭнзим», Россия).
Секвенирование продуктов амплификации локуса 16S рРНК, 23S рРНК и экстрахромосомной плазмиды штамма хламидий Ростиново-70 выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим», GenBank A/N штамма Ростиново-70: DQ663788 – локус 16S рРНК; DQ663789 – локус 23S рРНК; DQ663790 – локус экстрахромосомной плазмиды хламидий.

Результаты исследований. После проведения ПЦР, используя праймеры 16SIGF и 16SIGR, с экстрактами ДНК очищенных штаммов хламидий Ростиново-70, 250, ПП-87 и КС-93, у всех 4 штаммов были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона локуса 16S рРНК длиной 294 bp, при последующем эндонуклеазном расщеплении которого ферментом AluI были получены 2 дискретных фрагмента длиной 216 и 78 bp.

После проведения ПЦР с праймерами U23F и 23SIGR были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона локуса 23S рРНК длиной 604 bp, при последующем эндонуклеазном расщеплении которого ферментом AluI были получены 4 дискретных фрагментов длиной 461, 73, 59 и 11 bp.

После проведения ПЦР, используя праймеры ML-PLF01 и ML-PLR01, были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона локуса экстрахромосомной плазмиды длиной 469 bp, при последующем эндонуклеазном расщеплении которого ферментом AluI были получены 3 дискретных фрагмента длиной 351, 89 и 29 bp.

Рекомендуем прочитать:  Как наш кот завёл собаку

Праймеры на выявление экстрахромосомной плазмиды инициировали также амплификацию минорного неспецифичного фрагмента размером приблизительно 300 bp, который существенно не повлиял на корректную интерпретацию результата секвенирования.
Обсуждение. В данной работе проведен молекулярно-генетический анализ штаммов хламидий из коллекции микроорганизмов ФГУ ФЦТРБЖ по 16S рРНК и 23S рРНК с соответствующими фрагментами геномов официально зарегистрированных видов хламидий, а также наличию экстрахромосомной плазмиды.

При использовании протокола индикации хламидий праймерами 16SIGF и 16SIGR [5] с последующим анализом 16S рРНК-ПДРФ-А1и1-профиля было установлено, что исследуемые экстракты ДНК штаммов Ростиново-70, 250, ПП-87 и КС-93 дали аналогичные между собой результаты и соответствовали общему профилю семейства Chlamydiaceae.

Следует отметить, что 16S рРНК-гетерогенность штамма Ростиново-70 по отношению к штамму 6BC Chlamydophila psittaci составляет 1 нуклеотид, а по отношению к штамму S26/3 Chlamydophila abortus – 3 нуклеотида.

При использовании протокола индикации хламидий праймерами U23F и 23SIGR [5] с последующим анализом 23S рРНК-ПДРФ-AluI-профиля было установлено, что исследуемые экстракты ДНК штаммов Ростиново-70, 250, ПП-87 и КС-93 дали аналогичные между собой результаты и соответствовали общему профилю семейства Chlamydiaceae.

Секвенированная последовательность частичного 23S рРнК-гена штамма Ростиново-70 имела 100% идентичность с соответстующими последовательностями штаммов GD, CT1 и Par1, а 23S рРНК-гетерогенность данных штаммов по отношению к штамму 6BC Chlamydophila psittaci составляет 2 нуклеотида, а по отношению к штамму S26/3 Chlamydophila abortus – 8 нуклеотидов.
Штаммы Ростиново-70, 250, ПП-87 и КС-93 имеют экстрахромосомную плазмиду, чья нуклеотидная последовательность (GenBank A/N: DQ663790) на 100% идентична последовательности экстрахромосомной плазмиды штамма 84/2334 Chlamydophila psittaci (GenBank A/N: X62475).

Несмотря на то, что исследованные штаммы хламидий по результатам анализа 16S рРНК, 23S рРНК и наличию экстрахромосомной плазмиды когерентны к виду Chlamydophila psittaci, для заключения о таксономической принадлежности штаммов Ростиново-70, 250, ПП-87 и КС-93 необходима комплексная процедура идентификации хламидий по широкому спектру генетических маркеров, включая анализ генов, кодирующих белки наружной мембраны хламидий (omp1 и omp2) с учетом экологического критерия [6].

Рекомендуем прочитать:  Завершена разработка «умного» поводка для собак: концепция, характеристика, плюсы и минусы

Литература:

  1. Гаффаров Х.З., Михайлова Л.И., Кривоносов В.С. Выделение вируса из группы ОЛТ при энзоотическом аборте овец // Ветеринария. – М. 1971. – №7. – С.109-111.
  2. Курбанов И.А., Попова О.М., Терских И.И., Гизатуллин Х.Г. Возбудители группы ОЛТ в этиологии абортов коров // Ветеринария. – 1973. – № 7. – С.36.
  3. Курбанов И.А., Боровик Р.В., Попова О.М., Габдулхаев Т.Г., Митрофанов П.М. Аборты крупного рогатого скота хламидиозной этиологии//Ветеринария. – 1978. – №2. – С.66-70.
  4. Равилов Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных (этиология, диагностика, профилактика и меры борьбы): Дисс. … докт. вет. наук. – Казань, 1998. 316 с.
  5. Everett K.D., Bush R.M., Andersen A.A. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. Pt. 2. P. 415-440.
  6. Van Loock M., Vanrompay D., Herrmann B., Vander Stappen J., Volckaert G., Goddeeris B.M., Everett K.D. Missing links in the divergence of Chlamydophila abortus from Chlamydophila psittaci // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. Pt. 3. P. 761-70.

Summary
Vafin R.R., Karimov V.Zh., Ravilov R.Kh.,: The analysis of structure of 16S rRNA, 23S rRNA and extrachromosomal plasmid genes at Chlamydia. Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Kazan, Russia

The molekuljarno-genetic analysis of our collection of microorganisms on 16S rRNA and 23S rRNA genes with corresponding fragments genoms of officially registered kinds Chlamydia and to presence of extrachromosomal plasmid is carried out.

Источник: материалы 17-Московского международного ветеринарного конгресса

Добавить комментарий